清华大学化学系瑕瑜课题组于近日在Analytica Chimica Acta杂志上发表了题为“Lipidome-Wide Characterization of Phosphatidylinositols and Phosphatidylglycerols on C=C Location Level”的论文。该工作结合甲基化反应和在线Paternò-Büchi（PB）反应，实现了PG和PI亚类的高灵敏度C=C位置异构体鉴定，并应用于牛肝和人血浆的脂质组分析。对比二型糖尿病人和健康人血浆样本还发现，PI的C=C位置异构体可作为潜在生物标志物。
磷脂类的PI和PG在哺乳动物细胞中含量仅占总脂质的5% mol%和< 1% mol%，血浆中含量则更低。它们参与生物体内的信号传导、脂质蛋白相互作用等多种生理过程。然而，PI和PG脂质组中的C=C位置等异构现象无法通过传统的脂质组学方法解析，阻碍了其代谢与功能的进一步研究。近年来臭氧诱导解离（OzID）、紫外光解离（UVPD）、环氧化反应等C=C定位方法被相继发展。此前，瑕瑜课题组也报道了结合紫外光激发的液相丙酮PB反应和CID MS/MS用于脂质C=C位置异构体的鉴定和相对定量，可与LC-MS耦合，实现在线反应和高通量的脂质组分析。正离子模式下，脂质PB产物可在CID MS/MS中高效产生一对诊断离子定位C=C。而负离子模式下，PB产物CID会首先产生PB衍生化的脂肪酸链，需要MS3 CID得到诊断离子，并且对于多不饱和脂肪酸链（PUFA）还存在CO2丢失过程的干扰。因此易在负离子模式下电离的PG和PI目前还没有灵敏的C=C定位方法。
以往研究表明磷酸基团的甲基化有助于提高脂质在正离子模式下电离效率。因此，本文作者使用三甲基硅基重氮甲烷（TMSD）甲基化PG和PI，将其电离模式转换至正离子模式与在线PB反应及LC-MS/MS耦合。作者首先使用PG和PI标准品进行离线甲基化，证明TMSD甲基化可实现定量转化率，提高PG和PI正离子模式电离效率。PG和PI甲基化产物（PGMe和PIMe）可分别由203 Da和291 Da的中性丢失进行鉴定。随后，作者发现PGMe和PIMe的PB产物在CID MS/MS中产生C=C位置诊断离子效率也高于未甲基化的PG和PI。PB产率约10%-20%，最终C=C定位检测限可达5 nM。此外，该方法还适用于含PUFA的PG和PI，得到高质量C=C诊断离子。
作者随后使用商业牛肝脂质提取液分析发展了PI和PG脂质组鉴定流程。作者利用HILIC柱分离PI和PG亚类，丙酮同时作为流动相成分和PB反应试剂。作者首先用甲基化样品在正离子模式LC-MS/MS中利用中性丢失鉴定PG和PI；随后用未反应样品在负离子模式下由LC-MS/MS得到脂肪酸链信息；最后在正离子模式下用甲基化样品由LC-PB-MS/MS收集C=C位置信息。在牛肝脂质中，作者共鉴定到31种PG和49种PI。基于诊断离子强度，作者对含C18:1链脂质的C=C位置异构体（Δ9和Δ11）进行了相对定量，发现PG中Δ11异构体占比显著高于PI中。
最后，作者将该流程应用于人血浆样本。在亚类和脂肪酸链水平仅能鉴定26种和38种PI，而在C=C位置水平共检测到52种。由于血浆中PG含量极低，未能实现PG C=C水平鉴定。作者对比二型糖尿病人（N=5）和健康人样本（N=5）含C18:1的PI C=C位置异构体发现，PI 16:0_18:1和PI 18:0_18:1中Δ9/Δ11比例在两组样本间存在显著差异。同时，PI亚类在人与人之间相对标准偏差可达70%，而其C=C位置异构体比例在人与人之间相对标准偏差小于20%。
总之，作者结合磷酸甲基化反应和LC-PB-MS/MS方法，实现了PG和PI C=C位置的高通量、高灵敏分析，并将其应用于牛肝和人血浆的脂质组分析。作者还发现PI中的C=C位置异构体有望用于糖尿病相关的生物标志物研究。本文通讯作者为清华大学化学系瑕瑜教授，第一作者为2018级博士生夏天。
本文编辑：任翰林 审核：夏天
本文链接：https://doi.org/10.1016/j.aca.2020.06.017
本文引用：DOI: 10.1016/j.aca.2020.06.017